一、實驗原理
細胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從體內(nèi)獲取的組織細胞進行培養(yǎng)為原代培養(yǎng);當(dāng)原代培養(yǎng)的細胞增殖達到一定密度后,則需要做再培養(yǎng), 即將培養(yǎng)的細胞分散后,從一個容器以1:2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個或幾個容器中擴大培養(yǎng),為傳代培養(yǎng),傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細胞的代數(shù)。
細胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融,實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或DMSO作保護劑,這兩種物質(zhì)能提高 細胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外,減少細胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復(fù)蘇細胞應(yīng)采用快速融化的方 法,這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。
二、實驗方法
材料:
小鼠,生理鹽水,100ml滅菌燒杯,15ml離心管,培養(yǎng)皿,滴管,無菌鑷子、剪刀,篩網(wǎng),泡沫板,大頭針,酒精燈,培養(yǎng)瓶,培養(yǎng) 液,PBS,0.25%胰酶,超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡,顯微鏡,計數(shù)板,離心機,恒溫水浴箱,冰箱(4℃、-20℃、-70℃),液氮 罐,凍存管,凍存液,廢液缸等。
方法:
(1)原代培養(yǎng):
1.取出小鼠后瀝干酒精,放入超凈臺內(nèi),固定在泡沫板上。
2.用鑷子提起皮膚,用解剖剪剪開皮膚一個橫切口,將皮膚向上撕開,然后剪開肌肉等,暴露出腹腔,在左側(cè)找到脾臟,用彎頭眼科鑷取出脾臟,置于無菌培養(yǎng)皿中。
3.用生理鹽水將取出的脾臟清洗多次,并剔除多余無用的組織。
4.將篩網(wǎng)置于平皿中,脾臟置于篩網(wǎng)上,用彎頭鑷鑷住,輕輕在篩網(wǎng)上進行碾磨,同時不停滴加不含血清的培養(yǎng)液沖洗。
5.將碾磨好的細胞懸液吸入至離心管中,離心(1000rpm,5min),吸去上清(去除血液等)。
6.加入10ml培養(yǎng)液,吹打混勻,取樣計數(shù)。
7.將稀釋好的細胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中,輕輕搖晃混勻,在培養(yǎng)瓶上。
面做好標(biāo)志,注明細胞、組別及日期。然后將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(2)傳代培養(yǎng):
1.倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),確定細胞是否需要傳代。
2.培養(yǎng)液瓶打開后,過酒精燈火焰,置酒精燈火焰周圍。
3.拿出直頭滴管,套上橡皮吸頭,過火,放入培養(yǎng)液瓶中。
4.打開培養(yǎng)瓶,瓶口過火,將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液輕輕倒入廢液缸,用2-3mLPBS洗去殘留的舊培養(yǎng)基。
5.培養(yǎng)瓶加入0.25%胰酶,用量以薄薄蓋滿一層為宜,37℃消化,倒置顯微鏡下觀察到細胞收回突起變圓時立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使細胞脫離胰酶,然后將胰酶倒掉,加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基。
6.取彎頭滴管反復(fù)吹打細胞使其脫壁并分散,再根據(jù)分傳瓶數(shù)補加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基,制成細胞懸液,然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋,適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn),以利于CO2氣體的進入,將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。
7.對半貼壁培養(yǎng)細胞,不需胰酶,直接吹打,加入新鮮培養(yǎng)基,然后分裝到各瓶中。
(3)凍存:
1.吸取傳代后的細胞懸液,離心,去除培養(yǎng)液,加入凍存液,分裝凍存管(凍存管內(nèi)細胞數(shù)目一般為(5~10)×106個/ml,2ml凍存管中一般放1~1.5ml細胞)。
2.按步凍存
o冷凍保存方法一:標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/min;當(dāng)溫度達-25℃以下時,可增至-5~-10℃/min;到-100℃時,則可迅速浸入液氮中。
o冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之程序降溫機中每分鐘降1~3℃至-80℃以下,再放入液氮長期保存。
(4)復(fù)蘇:
1.取出冷凍管,立即放入37℃水浴箱中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化,移入無菌操作臺內(nèi)。
2.打開凍存管,將細胞懸液吸到離心管中。
3.1000rpm離心10分鐘,棄去上清液。
4.加適當(dāng)培養(yǎng)液后將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng),第二天觀察生長情況。
三、實驗結(jié)果計算
1.一只小鼠可獲得(1~2.5)×108個脾細胞。
2.細胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁,并開始生長,如接種的細胞密度適宜,5天到一周即可形成單層。
3.一般情況,傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上,2~4天就可在瓶內(nèi)形成單層,需要再次進行傳代。
四、注意事項
1.取材要求新鮮,無菌,解剖小鼠時,注意不要損傷脾臟及其周圍的臟器,尤其是腸道等,防止污染脾臟。
2.沖洗脾臟時要盡量洗凈血污,去除無用組織,并要防止組織干燥。
3.碾磨后及時用清水沖洗篩網(wǎng),防止組織、細胞阻塞網(wǎng)孔。
4.計數(shù)前,注意吸盡平皿里的細胞,充分混勻,使細胞分散成單個細胞。
5.實驗操作應(yīng)在操作臺中央無菌區(qū)域內(nèi)進行,勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。
6.金屬器械不能在火焰中燒的時間過長,燒過的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織,以免造成組織損傷。
7.另外膠塞過火焰時也不能時間長,以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體,危害培養(yǎng)細胞。
8.吸取過營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼,因殘留在吸管頭中營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜,再用時會把有害物帶入營養(yǎng)液中。
9.不能用手觸及已消毒器皿瓶口、瓶塞內(nèi)部,吸管前部等所有可能與細胞接觸的部分,如已接觸,要用火焰燒灼消毒或取備品更換。
10.開啟、關(guān)閉長有細胞的培養(yǎng)瓶時,火焰滅菌時間要短。防止因溫度過高燒死細胞。
11.換液時傾倒廢液,瓶口不能接觸廢液缸,速度不能過快,防止廢液四濺。
12.吹打細胞時,要注意邊角的細胞是否吹打下來。
13.手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上,即不可以在開放容器上方操作。
14.每次操作只處理一株細胞,以免造成細胞交叉污染。
15.注意自身的安全,對于來自人源性或病毒感染的細胞株應(yīng)特別小心。操作過程中,應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生,小心有毒性試劑例如DMSO,并避免尖銳物品傷人等。
16.從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存,但最好為對數(shù)生長期細胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。
17.將凍存管放入液氮容器或從中取出時,要做好防護工作,以免凍傷。
18.凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。
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